ສິ່ງທີ່ PCR ຕ້ອງເຮັດດ້ວຍ DNA Sequencing ແລະປັບປຸງ Genes
ປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ polymerase ( PCR ) ແມ່ນເຕັກນິກການພັນທຸກໍາໂມເລກຸນສໍາລັບການເຮັດສໍາເນົາຫລາຍໆຊະນິດແລະເປັນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງຂະບວນການ sequencing ຂອງເຊື້ອໂຣກ.
ວິທີການຕິກິຣິຍາ Polymerase Chain ເຮັດວຽກແນວໃດ?
ສໍາເນົາ Gene ແມ່ນຖືກນໍາໃຊ້ຕົວຢ່າງຂອງ DNA, ແລະເຕັກໂນໂລຢີແມ່ນດີພໍທີ່ຈະເຮັດສໍາເນົາຫຼາຍຈາກຫນຶ່ງແກນດຽວຂອງ gene ທີ່ພົບໃນຕົວຢ່າງ. ການປັບຂະຫຍາຍ PCR ຂອງ gene ເພື່ອເຮັດໃຫ້ຫຼາຍລ້ານແຜ່ນສໍາຫຼວດ, ອະນຸຍາດໃຫ້ສໍາລັບການຊອກຄົ້ນແລະການກໍານົດລໍາດັບຂອງເຊື້ອໂຣກໂດຍໃຊ້ເຕັກນິກຕາໂດຍອີງໃສ່ຂະຫນາດແລະການຄິດໄລ່ (+ ຫຼື -) ຂອງຊິ້ນ DNA.
ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ຄວບຄຸມ, ສ່ວນຂະຫນາດນ້ອຍຂອງ DNA ແມ່ນຖືກສ້າງຂື້ນໂດຍ enzymes ທີ່ເອີ້ນວ່າ DNA polymerases, ເຊິ່ງເພີ່ມ deoxynucleotides (dNTPs) ກັບຊິ້ນ DNA ທີ່ເອີ້ນວ່າ "ແມ່ແບບ". ເຖິງແມ່ນວ່າຕ່ອນນ້ອຍຂອງ DNA, ເອີ້ນວ່າ "primers" ແມ່ນໃຊ້ເປັນຈຸດເລີ່ມຕົ້ນສໍາລັບ polymerase. ຕົ້ນສະບັບແມ່ນຕ່ອນ DNA ທີ່ມີຂະຫນາດນ້ອຍຂອງມະນຸດ (oligomers), ປົກກະຕິແລ້ວໃນລະຫວ່າງ 15 ແລະ 30 nucleotides ຍາວ. ພວກມັນຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍການຮູ້ຫຼືການຄາດເດົາຂອງລໍາດັບ DNA ສັ້ນໆຢູ່ປາຍສຸດຂອງໂປຼຕີນທີ່ຖືກຂະຫຍາຍອອກ. ໃນໄລຍະ PCR, DNA ກໍາລັງຖືກ sequenced ແມ່ນຮ້ອນແລະ strands ສອງແຍກ. ເມື່ອເຮັດຄວາມເຢັນ, primers ຈະເຊື່ອມໂຍງກັບແມ່ແບບ (ເອີ້ນວ່າລອກລອກ) ແລະສ້າງສະຖານທີ່ສໍາລັບ polymerase ເພື່ອເລີ່ມຕົ້ນ.
The PCR Technique
ປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ polymerase (PCR) ໄດ້ເຮັດໃຫ້ເປັນໄປໄດ້ໂດຍການຄົ້ນພົບຂອງ thermophiles ແລະ thermophilic polymerase enzymes (enzymes ທີ່ຮັກສາສົມບູນໂຄງສ້າງແລະການເຮັດວຽກຫລັງຈາກຄວາມຮ້ອນໃນອຸນຫະພູມສູງ).
ຂັ້ນຕອນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບວິທີການ PCR ມີດັ່ງນີ້:
- ການປະສົມປະສານແມ່ນສ້າງຂື້ນກັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ດີທີ່ສຸດຂອງແບບ DNA, enzyme polymerase, primers, ແລະ dNTPs. ຄວາມສາມາດໃນການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຂອງການປະສົມໂດຍບໍ່ມີການສະແດງອອກຂອງ enzyme ອະນຸຍາດໃຫ້ສໍາລັບການສະທ້ອນອອກຂອງທໍ່ສອງຕົວຂອງຕົວຢ່າງ DNA ຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມໃນລະດັບຂອງ 94 ອົງສາເຊນຊຽດ.
- ການປະຕິບັດຕາມການປະຕິເສດ, ຕົວຢ່າງແມ່ນເຢັນໄປສູ່ລະດັບຄວາມປານກາງຫຼາຍກວ່າ, ປະມານ 54 ອົງສາ, ເຊິ່ງສະຫຼັບການເຊື່ອມໂຍງ (ການຜູກມັດ) ຂອງ primers ກັບເອກະສານ DNA ແບບດຽວ.
- ໃນຂັ້ນຕອນທີສາມຂອງວົງຈອນ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກ reheated ເຖິງ 72 ອົງສາ, ອຸນຫະພູມທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບ Taq DNA Polymerase, ສໍາລັບການຍືດຍາວ. ໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍຕົວ, DNA polymerase ໃຊ້ DNA strand ຕົ້ນສະບັບເປັນເອກະສານເພື່ອເພີ່ມ dNTPs ສົມບູນກັບປາຍ 3 'ຂອງ primer ແຕ່ລະຄົນແລະສ້າງພາກສ່ວນຫນຶ່ງຂອງ DNA ທໍ່ສອງໃນພາກພື້ນຂອງຊະນິດທີ່ມີຄວາມສົນໃຈໄດ້.
- ຕົ້ນສະບັບທີ່ໄດ້ລວບລວມກັບລໍາດັບ DNA ທີ່ບໍ່ແມ່ນຄໍາທີ່ກົງກັນຂ້າມບໍ່ໄດ້ຖືກລວບລວມຢູ່ໃນ 72 ອົງສາ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງຈໍາກັດການຍືດເຍື້ອຂອງຊະນິດທີ່ມີຄວາມສົນໃຈ.
ຂະບວນການຂອງການປະຕິເສດ, ການລອກລວງແລະການຍືດຫຍຸ່ນແມ່ນຊ້ໍາຫລາຍ (30-40) ເວລາ, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ຈໍານວນສໍາເນົາຂອງຊະນິດທີ່ຕ້ອງການໃນການປະສົມນັ້ນເພີ່ມຂຶ້ນຈໍານວນ. ເຖິງຢ່າງໃດກໍ່ຕາມຂະບວນການນີ້ອາດຈະມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກຫຼາຍຖ້າຫາກວ່າການປະຕິບັດດ້ວຍຕົນເອງ, ຕົວຢ່າງສາມາດກຽມພ້ອມແລະຕິດຢູ່ໃນເຕັກໂນໂລຢີທີ່ສາມາດກໍານົດໄດ້, ເຊິ່ງເປັນປະກະຕິທົ່ວໄປໃນຫ້ອງທົດລອງໂມເລກຸນສ່ວນຫຼາຍ, ແລະປະຕິກິລິຍາ PCR ສໍາເລັດໃນ 3-4 ຊົ່ວໂມງ.
ຂັ້ນຕອນຂອງການອອກແບບແຕ່ລະຄົນຢຸດເຊົາຂະບວນການຂະຫຍາຍຕົວຂອງວົງຈອນກ່ອນຫນ້ານີ້, ດັ່ງນັ້ນການຕັດເສັ້ນໄຍໃຫມ່ຂອງ DNA ແລະຮັກສາມັນໃຫ້ປະມານຂະຫນາດຂອງໂປແກມທີ່ຕ້ອງການ.
ໄລຍະເວລາຂອງວົງເດືອນການຍືດຍາວສາມາດເຮັດໄດ້ດົນກວ່າຫຼືນ້ອຍກວ່າໂດຍອີງຕາມຂະຫນາດຂອງໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສົນໃຈແຕ່ໃນທີ່ສຸດ, ໂດຍຜ່ານໄລຍະຊ້ໍາຂອງ PCR, ສ່ວນໃຫຍ່ຂອງແມ່ແບບຈະຖືກຈໍາກັດເທົ່າກັບຂະຫນາດຂອງຊະນິດທີ່ມີຄວາມສົນໃຈດຽວເທົ່ານັ້ນ, ຍ້ອນວ່າມັນ ຈະໄດ້ຮັບການຜະລິດຈາກຜະລິດຕະພັນຂອງທັງສອງ primers.
ມີ ປັດໃຈ ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ ຫຼາຍສໍາລັບ PCR ທີ່ ປະສົບຜົນສໍາເລັດ ທີ່ສາມາດຈັດການເພື່ອປັບປຸງຜົນໄດ້ຮັບ. ວິທີການນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນການທົດສອບສໍາລັບຜະລິດຕະພັນ PCR ແມ່ນ agarose gel electrophoresis . ຊຶ່ງຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອແຍກ DNA fragments ໂດຍອີງໃສ່ຂະຫນາດແລະຄ່າໃຊ້ຈ່າຍ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຊິ້ນສ່ວນດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກເບິ່ງເຫັນດ້ວຍສີຍ້ອມຫຼື radioisotopes.
The Evolution
ນັບຕັ້ງແຕ່ການຄົ້ນພົບ PCR, DNA polymerases ນອກເຫນືອຈາກຕົ້ນສະບັບ Taq ໄດ້ຖືກຄົ້ນພົບ. ບາງຄົນເຫຼົ່ານີ້ມີຄວາມສາມາດ "readreading" ດີກວ່າຫຼືມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຢູ່ໃນອຸນຫະພູມສູງ, ດັ່ງນັ້ນການປັບປຸງ PCR ຄວາມສາມາດພິເສດແລະຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຜິດພາດຈາກການໃສ່ຕົວ dNTP ທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.
ການປ່ຽນແປງບາງ PCR ໄດ້ຖືກອອກແບບມາສໍາລັບການນໍາໃຊ້ສະເພາະແລະຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງເປັນປະຈໍາໃນຫ້ອງທົດລອງພັນທຸກໍາໂມເລິກ. ບາງຄົນເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນ PCR ເວລາທີ່ແທ້ຈິງແລະ Reverse-Transcriptase PCR. ການຄົ້ນພົບຂອງ PCR ຍັງໄດ້ນໍາໄປສູ່ການພັດທະນາ DNA sequencing, DNA fingerprinting ແລະເຕັກນິກການໂມເລກຸນອື່ນໆ.