ປະຕິກິລິຍາຕໍ່ສ່ວນປະກອບໃດໆຂອງຕິກິຣິຍາ Polymerase Chain Reaction (PCR) ສາມາດປ່ຽນແປງຄຸນນະພາບຂອງຜົນໄດ້ຮັບ, ໂດຍການປັບປຸງຫຼືຫຼຸດລົງຜົນຜະລິດແລະຄຸນນະພາບຂອງຜະລິດຕະພັນຫຼືໂດຍການປັບປຸງຄວາມເສຖີຍນພາບແລະຄວາມເລິກຂອງຕິກິລິຍາ. ພາລາມິເຕີທີ່ມີອິດທິພົນຕໍ່ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ສຸດສາມາດເປັນທາງດ້ານຮ່າງກາຍ (ເຊົ່ນອຸນຫະພູມເວລາວົງຈອນ) ຫຼືສານເຄມີ (ຕົວຢ່າງ, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂປຣແກຣມ, ປະເພດຂອງເອນໄຊນໍາໃຊ້). ຕໍ່ໄປນີ້ແມ່ນປັດໃຈສໍາຄັນທີ່ມີອິດທິພົນຕໍ່ຜົນສໍາເລັດຂອງ PCR.
01 ຄວາມສະອາດຫ້ອງທົດລອງທີ່ສະອາດ
ເນື່ອງຈາກວ່າ PCR ແມ່ນສາມາດກວດພົບ DNA molecule ດຽວ, ມັນເປັນສິ່ງສໍາຄັນທີ່ຈະຮັກສາສະພາບທີ່ດີໃນຫ້ອງທົດລອງ. ສະເຫມີໃສ່ຖົງມືໃຫມ່, ຈົ່ງໃຊ້ແກ້ວທີ່ບໍ່ດີ, ທໍ່ແລະທໍ່ທາງທໍ່ແລະວິທີແກ້ໄຂທີ່ບໍ່ດີ, ແລະເຮັດຄວາມສະອາດພື້ນທີ່ເຮັດວຽກກ່ອນທີ່ຈະເລີ່ມຕົ້ນເຮັດວຽກ.
ສະເຫມີປະກອບມີຕິກິລິຍາການຄວບຄຸມ, ໂດຍບໍ່ມີ DNA template ແລະໂດຍບໍ່ມີ enzyme, ເພື່ອຮັບປະກັນຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນແທ້ໆເນື່ອງຈາກການຂະຫຍາຍຕົວຂອງຕົວຢ່າງທີ່ຖືກຕ້ອງ.
ຄົນສ່ວນໃຫຍ່ຫມັ້ນໃຈວ່າມີຊຸດໂຊລູຊັ່ນຂອງຕົນເອງທີ່ບໍ່ໄດ້ແບ່ງປັນເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫາການແກ້ໄຂບັນຫາທີ່ງ່າຍດາຍແລະຖືກກໍານົດໄວ້ສໍາລັບ PCR ເທົ່ານັ້ນ. ທໍ່ PCR DNase ແລະ RNase ຟຣີ, ທໍ່ pipette ທີ່ທົນທານຕໍ່ອາກາດແລະການເຮັດວຽກໃນລະດູຫນາວທີ່ມີແສງ UV ແມ່ນວິທີທີ່ຈະຫຼຸດຜ່ອນບັນຫາ.
02 ອົງປະກອບເຄມີ
- ມີ 18 ຫາ 24 ຖານ
- ບໍ່ມີໂຄງປະກອບການທີສອງ (ເຊົ່ນວົງເລັບ)
- ມີການແຈກຢາຍທີ່ສົມດູນຂອງຄູ່ G / C ແລະ A / T
- ບໍ່ສົມບູນກັບແຕ່ລະຄົນຢູ່ທີ່ປາຍ 3 ຕີນ
- ມີອຸນຫະພູມທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (Tm) ປະມານ 5-10 ອົງສາເຊນຊຽດພາຍໃຕ້ອຸນຫະພູມຂອງການລີດ, ຊຶ່ງມັກຈະລະຫວ່າງ 55 ແລະ 65 ອົງສາເຊນຊຽດ
Tm ສໍາລັບ primer ທັງສອງຄວນຈະມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນສໍາລັບຜົນໄດ້ຮັບທີ່ດີທີ່ສຸດ.
03 Reaction Mix: Template and Primers
ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ primer ທີ່ດີທີ່ສຸດແມ່ນຢູ່ໃນລະຫວ່າງ 0.1 ແລະ 0.6 micromoles / L. ຈໍານວນຮູບແບບທີ່ແຕກຕ່າງກັນແມ່ນຂຶ້ນຢູ່ກັບປະເພດຂອງ DNA (ມະນຸດ, ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, plasmid).
ມີຈໍານວນແບບຈໍານວນຫນ້ອຍທີ່ສຸດ, ມີກົນລະຍຸດອື່ນໆເພື່ອປັບປຸງຜົນໄດ້ຮັບ, ເຊັ່ນ: ຈໍານວນວົງຈອນເພີ່ມຂຶ້ນຫຼືການໃຊ້ "ການເລີ່ມຕົ້ນຮ້ອນ". ສະເຫມີທົດສອບ primers ໃຫມ່ທີ່ມີຕິກິຣິຍາຄວບຄຸມໃນທາງບວກ, ເພື່ອໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າພວກເຂົາເຮັດວຽກພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທົດລອງຂອງທ່ານ.
04 Reaction Mix: Enzyme Activity
ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ MgCl2 ໃນການປະຕິກິລິຍາປະສົມປະສານສາມາດສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ PCR ແລະສາມາດມີບົດບາດສໍາຄັນໃນການຕິກິຣິຍາໄວໆ. ສານປະສົມແມກນີຊຽມເຮັດໃຫ້ທາດສະລັບສັບຊ້ອນ soluble ກັບ dNTPs ເພື່ອຜະລິດສະຖາປັດຕະທີ່ແທ້ຈິງທີ່ enzyme polymerase ໄດ້ຮັບຮູ້.
ຈໍານວນເທົ່າທຽມກັນຂອງທັງສີ່ dNTPs ຍັງຊ່ວຍຫຼຸດຜ່ອນອັດຕາການຜິດພາດ polymerase. ບາງສິ່ງທີ່ເພີ່ມເຕີມເຊັ່ນ betaine, BSA, ເຄື່ອງດູດຝຸ່ນ, DMSO, glycerol ແລະ pyrophosphatase ກໍ່ສາມາດມີຜົນຕໍ່ປະສິດທິພາບຂອງເອນໄຊຫຼືປະສິດທິພາບຂອງປະຕິກິລິຍາ.
05 ປະເພດຂອງ Thermocycler
ເມື່ອຊື້ເຄື່ອງອຸປະກອນຫ້ອງທົດລອງ, ຈົ່ງຈື່ວ່າ thermocyclers ບາງແມ່ນຫນ້ອຍກ່ວາທີ່ຊັດເຈນກວ່າຄົນອື່ນໆໃນການຮັກສາອຸນຫະພູມທີ່ຕ້ອງການຄືກັນ.
ນີ້ແມ່ນເຂດພື້ນທີ່ທີ່ບໍ່ມີຄ່າໃຊ້ຈ່າຍໃນໄລຍະຍາວໃນເວລາທີ່ທ່ານກໍາລັງປະເຊີນກັບການຕິກິຣິຍາ finicky ຫຼືການນໍາໃຊ້ primers ທີ່ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີລະດັບອຸນຫະພູມແຄບ.
ທໍ່ປະຕິກິລິຍາທີ່ມີນ້ໍາຕານທີ່ຖືກອອກແບບມາເພື່ອໃຫ້ເຫມາະສົມກັບຍີ່ຫໍ້ thermocycler ທີ່ທ່ານໃຊ້, ກໍ່ຊ່ວຍເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງອຸນຫະພູມປະຕິກິລິຍາ.
06 Cycle Settings
ຜົນຜະລິດທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນສາມາດບັນລຸໄດ້ໂດຍການເພີ່ມເວລາການຂະຫຍາຍເວລາກ່ຽວກັບຮອບ 20 ຮອບ, ເພື່ອຊົດເຊີຍການ enzyme ຫນ້ອຍເພື່ອຂະຫຍາຍຮູບແບບຫຼາຍ. ປົກກະຕິແລ້ວ, ຫນ້ອຍກວ່າ 40 ຮອບແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະຂະຫຍາຍໂມເລກຸນແບບນ້ອຍກວ່າ 10 ເພື່ອໃຫ້ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ພຽງພໍທີ່ຈະເບິ່ງກ່ຽວກັບ gel agarose ຂອງ bromide ethidium.