ການກໍານົດລໍາດັບ DNA ແມ່ນຂຶ້ນກັບຄວາມສາມາດຂອງພວກເຮົາທີ່ຈະໃຊ້ electrophoresis gel ເພື່ອແຍກ DNA strands ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນຂະຫນາດໂດຍເທົ່າໃດເປັນຫນຶ່ງຄູ່ຖານ.
DNA Sequencing
ໃນທ້າຍຊຸມປີ 1970, ສອງເຕັກນິກການ sequencing DNA ສໍາລັບໂມເລກຸນ DNA ຍາວໄດ້ຖືກ invented. ເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນວິທີການ Sanger (ຫຼື dideoxy) ແລະວິທີການ Maxam-Gilbert (ການເຄືອບສານເຄມີ). ວິທີການ Maxam-Gilbert ແມ່ນອີງໃສ່ການແຍກຕາມກົດຫມາຍໂດຍໃຊ້ສານເຄມີແລະຖືກນໍາໃຊ້ທີ່ດີທີ່ສຸດສໍາລັບລໍາດັບ oligonucleotides (polymers nucleotide ສັ້ນ, ປົກກະຕິແລ້ວມີຂະຫນາດນ້ອຍກວ່າ 50 ຄູ່ຖານຄູ່). ວິທີການ Sanger ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍທົ່ວໄປເນື່ອງຈາກວ່າມັນໄດ້ຮັບການສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າງ່າຍຕໍ່ການສະຫມັກທາງດ້ານວິຊາການ, ແລະມີການນໍາ ໃຊ້ PCR ແລະອັດຕະໂນມັດເຕັກນິກວິທີການນໍາໃຊ້ໄດ້ຢ່າງງ່າຍດາຍ. ເຕັກນິກນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ການສິ້ນສຸດຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ໂດຍ dideoxynucleotides ໃນລະຫວ່າງການກະຕຸ້ນການຂະຫຍາຍພັນ PCR.
Sanger Method
ໃນວິທີການ Sanger, strand DNA ທີ່ຈະໄດ້ຮັບການວິເຄາະຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແມ່ແບບແລະ DNA polymerase ຖືກນໍາໃຊ້ໃນການປະຕິກິລິຍາ PCR ເພື່ອສ້າງ strands ທີ່ໃຊ້ primers.
ປະສົມປະສານ 4 ປະຕິກິລິຍາ PCR ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແຕ່ລະປະກອບດ້ວຍອັດຕາສ່ວນຫນຶ່ງຂອງສີ່ປະເພດຂອງ dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) ກັບຫນຶ່ງໃນສີ່ເຕັກນິກ (ATP, CTP, GTP ຫຼື TTP). ການສັງລວມຂອງ strand DNA ໃຫມ່ສືບຕໍ່ຈົນກວ່າຫນຶ່ງຂອງການປຽບທຽບເຫຼົ່ານີ້ຈະຖືກລວມເຂົ້າ, ໃນເວລາທີ່ strand ແມ່ນຖືກຕັດກ່ອນໄວອັນຄວນ.
ແຕ່ລະປະຕິກິລິຍາ PCR ຈະສິ້ນສຸດເຖິງປະສົມປະສານຂອງຄວາມຍາວແຕກຕ່າງກັນຂອງສາຍພັນ DNA, ທັງຫມົດສິ້ນສຸດດ້ວຍ nucleotide ທີ່ dideoxy ທີ່ຕິດສະຫຼາກສໍາລັບການປະຕິກິລິຍານັ້ນ. ຫຼັງຈາກນັ້ນກະ ແສໄຟຟ້າ ແມ່ນໃຊ້ເພື່ອແຍກຄວາມແຕກຕ່າງຂອງສີ່ປະຕິກິລິຍາໃນສີ່ເສັ້ນທາງແຍກຕ່າງຫາກແລະກໍານົດລໍາດັບຂອງແບບຕົ້ນສະບັບໂດຍອີງໃສ່ຄວາມຍາວຂອງສາຍທີ່ສິ້ນສຸດດ້ວຍສິ່ງທີ່ nucleotide.
ໃນການໂຕ້ຕອບ Sanger ອັດຕະໂນມັດ, primers ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ທີ່ມີການຕິດສະຫຼາກທີ່ມີສີ່ຫລ່ຽມທີ່ແຕກຕ່າງກັນສີ fluorescent. ປະຕິກິລິຍາ PCR, ໃນເວລາທີ່ມີ nucleotide dideoxy ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແມ່ນປະຕິບັດດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ. ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຕໍ່ໄປ, ສີ່ປະສົມປະຕິກິລິຢາໄດ້ຖືກລວມແລະນໍາໃຊ້ກັບເສັ້ນດຽວຂອງເຈນ. ສີຂອງຊິ້ນສ່ວນແຕ່ລະແມ່ນໄດ້ຖືກກວດພົບໂດຍໃຊ້ເລເຊີເລເຊີແລະຂໍ້ມູນຖືກເກັບລວບລວມໂດຍຄອມພິວເຕີທີ່ສ້າງໂຄຣດໂຄຣມທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນຈຸດສູງສຸດສໍາລັບແຕ່ລະສີ, ຈາກລໍາດັບ DNA ທີ່ສາມາດກໍານົດໄດ້.
ໂດຍປົກກະຕິ, ວິທີ sequencing ອັດຕະໂນມັດແມ່ນມີພຽງແຕ່ຄວາມຖືກຕ້ອງສໍາລັບລໍາດັບສູງເຖິງປະມານ 700-800 ຄູ່ຖານຄູ່ຍາວ. ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ມັນເປັນໄປໄດ້ທີ່ຈະໄດ້ຮັບລໍາດັບເຕັມຮູບແບບຂອງເຊື້ອໂຣກຂະຫນາດໃຫຍ່ແລະໃນຕົວຈິງແລ້ວ, genomes ທັງຫມົດ, ໂດຍນໍາໃຊ້ວິທີການຂັ້ນຕອນທີ່ສະຫລາດເຊັ່ນ Primer Walking ແລະ Shotgun sequencing.
ໃນການ ຍ່າງ ທາງເບື້ອງຕົ້ນ, ສ່ວນທີ່ເປັນປະໂຫຍດຂອງ gene ຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍວິທີການ Sanger. primers ໃຫມ່ແມ່ນຜະລິດຈາກສ່ວນທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຂອງລໍາດັບແລະໄດ້ນໍາໃຊ້ເພື່ອສືບຕໍ່ sequencing ສ່ວນຂອງ gene ທີ່ຢູ່ນອກລະດັບຂອງຕິກິລິຍາຕົ້ນສະບັບ.
ການຈັດລໍາດັບ Shotgun ໄດ້ແຊກ ແຊງສ່ວນ DNA ຂອງຄວາມສົນໃຈເຂົ້າໄປໃນສ່ວນທີ່ເຫມາະສົມ (ສາມາດຈັດການໄດ້) ຊິ້ນ, sequencing ຊິ້ນສ່ວນແລະຈັດແຈັດໂດຍອີງຕາມລໍາດັບທີ່ລອກເລີ້ມ. ເຕັກນິກນີ້ໄດ້ງ່າຍຂຶ້ນໂດຍການນໍາໃຊ້ຊອບແວຄອມພິວເຕີ້ສໍາລັບຈັດແຈັດຊິ້ນທີ່ຕິດກັນ.